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補(bǔ)腎填髓方對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶
能力及線粒體氧化應(yīng)激的影響
目的觀察補(bǔ)腎填髓方對(duì)阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease, AD)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及線粒體氧化應(yīng)激的影響。 方法50只大鼠先用Y迷宮初篩，再按曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分隨機(jī)分成正常組、模型組、假手術(shù)組、中藥組、西藥組。假手術(shù)組兩側(cè)側(cè)腦室注 射P淀粉樣蛋白（AP)424,佘下除正常組外均以雙側(cè)側(cè)腦室注射(AP)1^復(fù)制AD模型。造模后中藥組灌服補(bǔ)腎填髓方，西藥組灌服 多奈哌齊，其他組灌服等容量生理鹽水，連續(xù)干預(yù)28 d。Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測(cè)大鼠 腦皮質(zhì)及血清超氧化物歧化酶（superoxide dismufase, SOD)活性，硫代巴比妥酸法(TBA)檢測(cè)大鼠腦皮質(zhì)及血清丙二醛(malondi- aldehyde, MDA)活性，透射電鏡觀測(cè)海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠水迷宮逃避潛伏期縮短，在原 平臺(tái)象限游泳時(shí)間及距離的百分比增加，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，中藥組SOD活性升高，MAD 活性減低(P<0.05，P<0.01);西藥組的SOD活性升高，MDA活性降低(P<0.01);中藥組及西藥組的海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)病理?yè)p害改 善。結(jié)論補(bǔ)腎填髓方可以改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與改善線粒體氧化應(yīng)激有關(guān)。
〔關(guān)鍵詞〕阿爾茨海默病；補(bǔ)腎填髓方；氧化應(yīng)激；線粒體
阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease, AD)是與 年齡相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以進(jìn)行性記 憶下降及認(rèn)知損傷為特點(diǎn)[1]。由于人口老齡化，目前 世界范圍內(nèi)AD患病人數(shù)已經(jīng)達(dá)到4 400萬(wàn)[2]，給社 會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。AD的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且并 不*清楚，現(xiàn)在的治療藥物不能*臨床需 要，并且費(fèi)用昂貴，還存在肝毒性、腹瀉、惡心嘔吐、 頭暈等不良反應(yīng)[3]。因此，研究療效更確切、副作用 更少的AD治療藥物非常緊迫。近年來(lái)，大量文獻(xiàn)研 究報(bào)道，AD與氧化應(yīng)激聯(lián)系緊密，改善氧化應(yīng)激可 以明顯改善AD[4-6]。補(bǔ)腎填髓方是根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論 “腎虛髓虧”，基于經(jīng)典方劑孔圣枕中丹（《千金方》） 化裁而成，相關(guān)研究證實(shí)補(bǔ)腎填髓方藥能有效延緩 癡呆早期患者大腦結(jié)構(gòu)的萎縮，改善其認(rèn)知及記憶 功能'但其作用機(jī)制并不十分明確。本研究擬以 AD模型大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，從線粒體的氧化應(yīng)激角 度，探討補(bǔ)腎填髓方抗AD的作用機(jī)制。
1材料與儀器
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
90只健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(180±20)g， 購(gòu)自斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào):SYXK (湘）2010-0013;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源證號(hào)：430047000，飼 養(yǎng)于湖南省人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在 室溫22~25丈、濕度40%~60%條件下，以普通飼料 喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。將大鼠觀察性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行 Y迷宮實(shí)驗(yàn)初篩。
1.2實(shí)驗(yàn)藥物、試劑及儀器設(shè)備
補(bǔ)腎填髓方由石菖蒲10 g，遠(yuǎn)志10 g，何首烏 15 g，yin羊藿15 g，龜板20 g，龍骨20 g組成。鹽酸 多奈哌齊片，衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1611013。 ApW2，Sigma 公司，批號(hào)：A4559。A^42-1，Sigma 公司，
批號(hào):A2201(以無(wú)菌雙蒸水將ApM2及AP42-1配制成 濃度為2 pg/pL,置于37 t恒溫箱孵育7 d，保存于 4 °C 冰箱備用)。丙二醒(malondialdehyde,MDA)試劑 盒，南京建成，批號(hào)：A003-1。超氧化物歧化酶(su-peroxide dismufase, SOD)試劑盒 ，武 漢華美 ，批號(hào) ： P03037347。大鼠腦立體定位儀，美國(guó)K0PF(Model- 900)。Morris水迷宮，上海欣軟(XR-XM101)。Y迷宮， 上海軟隆(BW-MYM103)。透射式電子顯微鏡，美國(guó) FEI 公司(Tecnai G2 Spirit)。
2方法
2.1 AD大鼠模型的復(fù)制及干預(yù)
根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]行Y型迷宮初篩，剔除先天愚 鈍的大鼠，隨后依據(jù)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)得分將大鼠 分為正常組、假手術(shù)組、模型組、西藥組、中藥組，每 組10只。參照Xi等[9]方法，復(fù)制AD模型。除正常組 夕卜，各組大鼠以10%水合氯醛（350 mg/kg)腹腔注射 麻醉后俯臥固定于腦立體定位儀，常規(guī)備皮消毒，頭 頂正中切開(kāi)皮膚，找到大鼠前囟，結(jié)合《大鼠腦立體 定向儀圖譜》[10]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在大鼠兩側(cè)側(cè)腦室(位 置：前囟后1 mm，矢狀縫向左、右側(cè)勞開(kāi)1.5 mm， 深4.6 mm)用針頭鉆開(kāi)顱骨，假手術(shù)組兩側(cè)側(cè)腦室 注入AP42-1 5 pL，其余實(shí)驗(yàn)組緩慢注入ApM2 5 pL。 注入時(shí)間均為5 min，留針時(shí)間5 min，注射完畢后 縫合皮膚，局部紅霉素外涂防感染。
正常組不灌胃，其他組造模后隔天開(kāi)始灌胃。根 據(jù)人與大鼠換算系數(shù)0.018,以大鼠體質(zhì)量200 g，成 人體質(zhì)量60 kg為參考，西藥組按0.33 mg/(kg’d)、中 藥組按生藥量8.1 g/(kg，d)的劑量灌胃，給予藥液 8 mL/(kg，d)。模型組和假手術(shù)組灌服等容量生理鹽 水，連續(xù)給藥4周。
造模成功標(biāo)準(zhǔn)[8]:造模結(jié)束后第15天，對(duì)大鼠再次進(jìn)行Y型迷宮篩選，如15次測(cè)試中正確次數(shù) 比造模前下降1/3者為造模成功。共剔除死亡大鼠 5只，造模失敗3只，將存活的成功模型納人下一步 實(shí)驗(yàn)，其中假手術(shù)組8只，模型組7只，中藥組9只， 西藥組8只，正常組10只，成模率80%，并遵循隨 機(jī)原則補(bǔ)齊每組動(dòng)物為10只。
在各組大鼠28 d干預(yù)完成后，每天下午14:30 左右開(kāi)始定位航行訓(xùn)練，連續(xù)5 d。每天將大鼠面向 池壁分別從4個(gè)平均分布的標(biāo)記點(diǎn)輕輕放人水中， 記錄1 min內(nèi)其找到水下平臺(tái)所花費(fèi)的時(shí)間（逃 避潛伏期，escape latency)。第6天移除隱藏的平 臺(tái)，從定位航行實(shí)驗(yàn)的第1個(gè)人水點(diǎn)將大鼠放人水 池，記錄1 min內(nèi)大鼠經(jīng)過(guò)虛擬平臺(tái)的總次數(shù)，原平 臺(tái)象限的活動(dòng)時(shí)間與距離占總游泳時(shí)間及總游程 的百分比[11]。
水迷宮測(cè)試結(jié)束后，大鼠用10%水合氯醛 (350 mg/kg)麻醉，腹主動(dòng)脈采血后，斷頭取腦，碎冰上 迅速分離出大鼠前額皮質(zhì)，預(yù)冷的生理鹽水洗凈血zi， 吸干水分后稱質(zhì)量，制備成10%組織勻漿液，分別低 溫離心機(jī)3 500 r/min離心勻漿液及血液15 min，取 上清，按照SOD、MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定。
2.4電鏡觀察
大鼠麻醉處死后斷頭取腦，碎冰上分離大鼠海 馬，用2.5%戊二醛固定2 h以上，0.1 mmol/L磷酸 緩沖液清洗3次；1%鋨酸固定1~2 h，0.1 mmol/L 磷酸緩沖液漂洗3次；常規(guī)50%、70%、90%、100% 丙酮脫水，經(jīng)過(guò)浸泡、包埋、固化后超薄切片機(jī)切片， 檸檬酸鉛和醋酸鈾雙染，透射電鏡下放大20 000倍
觀察并拍照記錄。
2.5統(tǒng)計(jì)方法
用SPSS l7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均 用“x±s”表示，水迷宮逃避潛伏期采用重復(fù)測(cè)量方差 分析[12]，其余各組間比較使用單因素方差分析，組間 兩兩比較使用LSD檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。
3結(jié)果
3.1 水迷宮定位航行試驗(yàn)
隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，各組大鼠逃避潛伏期逐 漸縮短。與假手術(shù)組比較，模型組第3天開(kāi)始出現(xiàn)逃 避潛伏期延長(zhǎng)（P<0.01);與模型組比較，中藥組、西 藥組逃避潛伏期第3天開(kāi)始縮短(P<0.01 )。與西藥組 相比，中藥組逃避潛伏期稍有延長(zhǎng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1、表1
3.2水迷宮空間探索試驗(yàn)
與假手術(shù)組相比，模型組大鼠原平臺(tái)象限游泳時(shí) 間百分比及游泳距離百分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 〇P<0.01);與模型組相比，中藥組、西藥組游泳時(shí)間
及游泳距離的百分比升高(P<0.05或P<0.01);與西 藥組相比，中藥組原平臺(tái)象限游泳時(shí)間所占百分比 稍有降低，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中藥 組原平臺(tái)象限游泳距離所占百分比降低，兩者差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2、圖2。
表2補(bǔ)腎填髓湯對(duì)AD大鼠在原平臺(tái)象限游泳時(shí)間、
組別 | 游泳時(shí)間百分比 | 游泳距離百分比 |
正常組 | 59.06±10.39 | 29.22±6.46 |
假手術(shù)組 | 56.36± 11.40 | 27.99±4.22 |
模型組 | 28.61±9.86** | 16.07±3.39** |
西藥組 | 48.68±12.89## | 23.53±4.34## |
中藥組 | 44.27±9.95*## | 21.97±5.13**#“ |
F值 | 12.10 | 25.10 |
P值 | 0.000 | 0.000 |
距離百分比的影響（X±s,n=10,%)
注：與假手術(shù)組比較，〒<0.05，*〒<0.01;與模型組比較，#尸<0.05, ##P<0.01;與西藥組比較，▲▲P<0.01
圖2各組大鼠空間探索軌跡圖
3.3補(bǔ)腎填髓方對(duì)大鼠前額皮質(zhì)組織及血清SOD、 MDA酶活性的影響
與假手術(shù)組比較，模型組SOD活性明顯下降，MDA 活性顯著升高(P<0.01);與模型組比較，中藥組、西 藥組SOD活性均升高，MDA活性均顯著下降(P<0.05或P<0.01);西藥組與中藥組SOD活性、MDA活性比 較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。
3.4補(bǔ)腎填髓方對(duì)大鼠海馬線粒體的影響
電鏡結(jié)果顯示，正常組和假手術(shù)組線粒體形態(tài) 清楚完整，大小、形狀規(guī)則，分布均勻且數(shù)目多，外膜 平整光滑，線粒體膜間隙無(wú)明顯擴(kuò)張，線粒體嵴排列 整齊呈板層狀，內(nèi)膜和嵴內(nèi)腔含有較多均勻的顆粒 狀基質(zhì)，未見(jiàn)線粒體水腫及空泡化改變。
模型組部分線粒體形態(tài)欠完整，結(jié)構(gòu)不清晰，體 積縮小，大小、形狀不規(guī)則，分布紊亂且數(shù)目減少，線 粒體外膜模糊，內(nèi)嵴大量斷裂或溶解消失，線粒體腫 脹，基質(zhì)疏松清淡，未見(jiàn)基質(zhì)顆粒，出現(xiàn)空泡化改變。 中藥組、西藥組大鼠線粒體組織結(jié)構(gòu)上較為完整清 晰，大小、形狀相對(duì)規(guī)則，數(shù)目較模型組增多，外膜可 見(jiàn)，尚光滑，內(nèi)嵴增多，排列比較整齊，偶可見(jiàn)嵴內(nèi)腔 稍有擴(kuò)大，內(nèi)嵴溶解減輕，部分線粒體腫脹明顯改 善，基質(zhì)較均勻，可見(jiàn)少許基質(zhì)顆粒。見(jiàn)圖3。
圖3各組大鼠海馬線粒體電鏡觀察圖（X20000)
4討論
AD是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾 病，P淀粉樣蛋白沉積成老年斑是AD病理標(biāo)志，并 且被認(rèn)為直接損害學(xué)習(xí)能力和記憶[13]，其中Ap^能
夠自我組裝形成寡聚體和淀粉樣纖維而具有很強(qiáng)的 細(xì)胞毒性;A Pw作為它的反序列肽，缺乏了自我組 裝及構(gòu)成毒性寡聚態(tài)的能力，不具有細(xì)胞毒性，故而 在許多研究中作為APi-2的對(duì)照肽[14]。條件恐懼、放 射狀迷宮、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、Y迷宮實(shí)驗(yàn)等均是 AD行為學(xué)評(píng)價(jià)的常用方法[15-16]。AD患者后期多伴 有如幻想、焦慮、抑郁等精神癥狀，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張 度的一種方法，常用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新異環(huán)境中的 焦慮狀態(tài)。初期就選擇Y迷宮進(jìn)行初篩，并配合曠 場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)分，既可避免Morris水迷宮初篩大鼠會(huì)遺 留對(duì)平臺(tái)記憶干擾后期Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果，又 可排除大鼠情緒原因引起自主活動(dòng)差異而影響終 的測(cè)試結(jié)果。造模后大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié) 果顯示，模型組逃避潛伏期延長(zhǎng)，在原平臺(tái)象限的游 泳時(shí)間和游泳距離百分比縮短，假手術(shù)組未見(jiàn)明顯 變化，表明模型大鼠學(xué)習(xí)記憶受損。
AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種因素參與了它的發(fā)病過(guò) 程，其中氧化應(yīng)激可能在其中占有重要的地位，大量 實(shí)驗(yàn)研究及回顧性研究均提出AD發(fā)生發(fā)展與氧化 應(yīng)激密切相關(guān)[17-19]。盡管生理濃度的活性氧在體內(nèi) 的一些信號(hào)通路中起著重要作用，但活性氧的過(guò)度 產(chǎn)生會(huì)引起脂質(zhì)、蛋白、核酸等分子損傷。MDA是一 種重要的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，表明了機(jī)體受氧化損傷的程 度。活性氧的消除主要通過(guò)酶促及非酶促兩種途徑， SOD是體內(nèi)重要抗氧化酶，可通過(guò)催化還原態(tài)單電 子氧轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫從而清除體內(nèi)氧自由基，減輕 氧化損傷的程度，維持生物體細(xì)胞成分正常的結(jié)構(gòu) 和功能[20]。通過(guò)抗氧化手段進(jìn)行干預(yù)，或可延緩疾病 向AD終末的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組血清及 皮質(zhì)抗氧化酶SOD活性均有下降，MDA活性均表 現(xiàn)升高趨勢(shì)；中藥組可以升高皮質(zhì)及血清中的SOD 活性，降低MDA活性。表明補(bǔ)腎填髓方可以增強(qiáng)機(jī) 體的抗氧化能力，拮抗過(guò)度產(chǎn)生的氧自由基，這與姜 招峰等™的研究有共通之處，其研究表明海馬及皮 層部位的氧自由基損傷與大鼠記憶及學(xué)習(xí)能力密切 相 關(guān)。
由于線粒體電子傳遞中不可避免的出現(xiàn)電子泄 露，成為了機(jī)體活性氧主要產(chǎn)生來(lái)源，90%內(nèi)源性氧自 由基均由線粒體而來(lái)，線粒體自身亦可受到氧自由基的 破壞，加劇線粒體的損傷，從而形成惡性循環(huán)[22]。本 研究通過(guò)電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示模型 組線粒體形態(tài)不完整，結(jié)構(gòu)破壞，體積變小，分布紊 亂且數(shù)目減少，出現(xiàn)空泡化改變，表明AD模型鼠線 粒體整體結(jié)構(gòu)受損；大鼠灌服中藥補(bǔ)腎填髓方能使 線粒體組織結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)，大小、形狀變得規(guī)則，數(shù) 目增多。表明補(bǔ)腎填髓方對(duì)受損的AD大鼠線粒體 結(jié)構(gòu)的破壞有改善作用。
AD屬于中醫(yī)學(xué)“癡呆”“呆證”的范疇，病性以 本虛標(biāo)實(shí)為主，以髓海空虛為本，痰濁、瘀血阻絡(luò)為 標(biāo)，而腎虛髓空是其根本原因。腎與腦之間有著密不 可分的聯(lián)系，“癡呆”的中醫(yī)藥治療多集中在補(bǔ)腎填 髓。老年癡呆臨床辨證分型流行病調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，髓海 不足證在所有證型中出現(xiàn)頻次zui高[23]。補(bǔ)腎填髓方 基于經(jīng)典方劑“孔圣枕中丹”（《千金方》）化裁而成， 以yin羊藿、何首烏為君藥，功效在于滋陰補(bǔ)腎、強(qiáng)精 益血；臣藥龜板、龍骨強(qiáng)精益髓，增慧添智；佐以遠(yuǎn) 志、石菖蒲開(kāi)竅豁痰，醒神益智。縱觀全方藥物組成， 主要功效在于補(bǔ)腎填髓，且兼顧了化痰開(kāi)竅。現(xiàn)代藥 理研究表明：yin羊藿中的成分yin羊藿苷可以通過(guò)抗 氧化應(yīng)激、抗炎、清除自由基、抑制乙酰膽堿酯酶的 活性以及抑制AP聚集等途徑發(fā)揮對(duì)AD的改善作 用[24]。何首烏主要水溶性成分二苯乙烯苷可改善擬 癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提高大鼠海馬組織CA1 區(qū)腦啡肽酶及低密度脂蛋白相關(guān)受體1表達(dá)，增強(qiáng) 對(duì)AP的降解和轉(zhuǎn)運(yùn)[25]。遠(yuǎn)志粗提物經(jīng)D101大孔吸 附樹(shù)脂富集后，發(fā)現(xiàn)皂苷類成分和黃酮類成分或許能 通過(guò)抗氧化應(yīng)激，改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能m。石菖蒲 的主要有效成分P-細(xì)辛醚可以改善認(rèn)知功能，其作用 機(jī)制包括了抑制炎癥因子IL-ip、TNF-a的分泌及下 調(diào)AQP4的表達(dá)來(lái)保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞[27]。
本實(shí)驗(yàn)顯示補(bǔ)腎填髓方可以改善AD大鼠的學(xué)習(xí) 記憶能力，增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激能力，且能夠改善線粒體的 結(jié)構(gòu)，其機(jī)制可能與改善線粒體相關(guān)的氧化應(yīng)激有 關(guān)，更深人的機(jī)制研究還需下一步進(jìn)行。
